無論是進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，純化或標(biāo)記，使用從細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)或用于研究生物分子之間相互作用的標(biāo)記物，蛋白質(zhì)都是臨床，診斷和研究實(shí)驗(yàn)室中的常見樣品。 蛋白質(zhì)濃度的測定是蛋白質(zhì)研究的關(guān)鍵部分。 在本應(yīng)用中，如何使用紫外吸收測量蛋白質(zhì)濃度，我們使用Ocean HDX光譜儀生成牛血清白蛋白（BSA）的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。 紫外波段的超高靈敏度，超低雜散光和高級(jí)光學(xué)元件，使得Ocean HDX成為UV吸收測量的理想選擇。

介紹

蛋白質(zhì)是生命的中心。 這些錯(cuò)綜復(fù)雜的生物分子在細(xì)胞過程，新陳代謝，催化生物化學(xué)反應(yīng)和作為結(jié)構(gòu)元素等方面發(fā)揮著重要作用，甚至更多。 作為所有生命的重要元素，蛋白質(zhì)往往是生物醫(yī)學(xué)診斷研究和生命科學(xué)研究的主要研究內(nèi)容。 不管所尋求的答案或蛋白質(zhì)來源如何，涉及蛋白質(zhì)的大多數(shù)研究開始于量化樣品中存在的蛋白質(zhì)的量。

蛋白質(zhì)濃度定量

定量蛋白質(zhì)濃度的方法分為兩組 – 使用UV吸光度的直接檢測，或使用與蛋白質(zhì)反應(yīng)以制備有色產(chǎn)物，并對其進(jìn)行比色可見吸光度分析。 在280nm處的直接吸光度測量 – 其中芳族氨基酸：色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸吸收 – 這種檢測相對較快，并且不用消耗蛋白質(zhì)。 使用試劑的比色測定可提供總蛋白質(zhì)濃度，但蛋白質(zhì)雜質(zhì)可能會(huì)影響測量結(jié)果。

不管用于蛋白質(zhì)定量的確切方法如何，第一步都是測量感興趣蛋白質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的幾種稀釋度的吸光度。 在直接紫外吸收法的情況下，將280nm處的吸光度相對于每個(gè)樣品的已知濃度繪圖。 根據(jù)比爾定律（也稱為比爾朗伯定律），溶液的吸光度直接取決于吸收分子的濃度和光線通過樣品的光程。 這種關(guān)系使我們能夠使用為我們已知的蛋白質(zhì)樣品生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定未知蛋白質(zhì)樣品的濃度。

比爾定律規(guī)定…

…其中

A（λ）是溶液對波長的吸光度值
ε（λ）是作為該波長下的吸收分子的摩爾吸光系數(shù)或消光系數(shù)（L / mol·cm）
c是溶液的濃度（mol / L）
l是光通過溶液所經(jīng)過的光程（cm）

未知蛋白質(zhì)濃度由通過數(shù)據(jù)點(diǎn)繪制的最佳擬合線進(jìn)行確定。 請注意，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分是唯一用于確定未知樣品濃度的區(qū)域。 測量值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍的樣品必須稀釋，直到吸光度落在線性范圍內(nèi)。 基于測量濃度范圍之外的數(shù)據(jù)或超出圖的線性區(qū)域的濃度預(yù)測無效。

我們使用配置用于UV吸光度測量的 Ocean HDX光譜儀來生成牛血清白蛋白（BSA）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。  Ocean HDX的高分辨率光學(xué)元件使其成為UV吸光度測量的理想選擇，并具有超低雜散光以獲得更高的最大吸光度水平，另外升級(jí)了的光學(xué)元件，可在緊湊的空間內(nèi)提供卓越的性能。

實(shí)驗(yàn)步驟

用水作為溶劑制備6mg / mL BSA（Sigma P/N A2153）儲(chǔ)備溶液并稀釋至0.02mg / mL，用于制定預(yù)測未知蛋白質(zhì)樣品濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。值得我們的注意的是，BSA經(jīng)常用作生成校準(zhǔn)曲線以預(yù)測蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。

使用OCEAN-HDX-UV-VIS光譜儀，DH-2000-BAL平衡氘鎢光源，CUV-UV比色皿支架，QP230-2-XSR極度抗紫外光纖兩根，并使用OceanView中的吸光度向?qū)нM(jìn)行吸光度測量。 由于BSA不在可見光區(qū)域產(chǎn)生吸收，因此我們只需使用氘燈用于測量。 將光源限制在發(fā)生吸光度的區(qū)域會(huì)減少測量中的雜散光，從而為更高濃度的樣品提供更高的最大吸光度水平。 光譜儀和光源預(yù)熱60分鐘，通過消除光譜儀和光線升溫至一致溫度時(shí)發(fā)生的漂移，提高測量的穩(wěn)定性。

測量是在一個(gè)石英比色皿中進(jìn)行的，該比色皿在測量之間未從比色皿支架上取下。 通過取出0.5mL樣品并用0.5mL水替換它，可實(shí)現(xiàn)直接在比色皿中進(jìn)行稀釋。 在將水添加到比色皿之后，使用一次性移液管來混合樣品，進(jìn)行稀釋至0.02mg / mL。

結(jié)果

下面的圖1顯示了使用Ocean HDX測量的蛋白質(zhì)吸收光譜。  Ocean HDX的超低雜散光性能使我們能夠測量280 nm處芳香族氨基酸峰的吸光度，幾乎達(dá)到3 AU。 注意，測量肽主鏈在220nm附近吸收的區(qū)域的吸光度值超過3AU（數(shù)據(jù)未顯示）。

由BSA吸光度數(shù)據(jù)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。在2.4和2.5 AU之間觀察到數(shù)據(jù)的平衡或滾降。 此滾降表示測量中存在雜散光。 雜散光（以不同程度存在于所有吸光度測量中）限制了系統(tǒng)可測量的最大吸光度值。

 雜散光是來自設(shè)計(jì)光路外部的光線，無意中落在探測器的任何部位，從而產(chǎn)生錯(cuò)誤的讀數(shù)。 檢測器不區(qū)分檢測器給定像素上的波長，它只是測量撞擊檢測器的光強(qiáng)度。 由于這個(gè)原因，如果光線在探測器上不應(yīng)有的像素（波長）處著陸，探測器將錯(cuò)誤地輸出該波長的讀數(shù)。 這種雜散光通常來自預(yù)期的光源，但在光譜儀內(nèi)散射并落在檢測器的錯(cuò)誤部分，但它也可能完全來自不同的源。 該燈設(shè)置系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)的最大吸光率的工作限制，并通過限制系統(tǒng)的黑暗程度來降低信噪比。 雜散光的常見來源包括光柵中的高階反射，光柵中的缺陷，光譜儀內(nèi)部的反射以及光譜儀外殼中的光泄漏。  Ocean HDX擁有在改尺寸下最小的雜散光和可測量的最大吸光度水平。

在圖3中，來自最高蛋白濃度的數(shù)據(jù)點(diǎn)已經(jīng)從圖中去除以評(píng)估測量的線性范圍。 如R2值的改善，表明該線的方程式更適合并且將提供更準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)濃度值，但是在2.5 AU下仍然有一些滾降。其他在4到4.5AU之間的吸光度，需要額外測量來評(píng)估該區(qū)域的線性。

使用該圖，使用最佳擬合線的方程計(jì)算未知BSA或其他蛋白質(zhì)樣品的濃度，其中y是未知樣品的吸光度值。

結(jié)論

標(biāo)準(zhǔn)曲線（也稱為校準(zhǔn)曲線）的是許多生物醫(yī)學(xué)，診斷和生命科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室中的典型應(yīng)用。 準(zhǔn)確測定蛋白質(zhì)濃度是涉及蛋白質(zhì)分析的第一步。 憑借超低雜散光，升級(jí)的光學(xué)元件和高紫外靈敏度， Ocean HDX非常適合測量紫外吸光度，包括確定未知蛋白質(zhì)濃度所需的測量。